La Real Audiencia funcionaba como supremo tribunal de justicia de la Nueva España, se creó el 13 de diciembre de 1527 por la real cédula —orden expedida por el rey de España— expedida por Carlos I.
Niño de Guzmán presidió la Primera Audiencia, pero el 12 de enero de 1530 se creó la Segunda Real Audiencia que fue presidida por Sebastián Ramírez de Fuenleal. A partir de 1535, los virreyes fungieron como presidentes de la Audiencia.
Además, la Audiencia contaba con ocho oidores y, en 1739, los oidores aumentaron a doce. Los oidores no podrían ser naturales de la Nueva España, tampoco podían mantener negocios o casarse, el propósito era que permanecieran imparciales y leales a la corona española. Entre los oidores de la Segunda Audiencia destaca Vasco de Quiroga.
También, existían otros funcionarios como fiscales, tesoreros, alguaciles e intérpretes de las lenguas indígenas.
En la Real Audiencia se llevaban a cabo juicios civiles, juicios criminales y apelaciones. Además, determinaba el tributo que los indígenas debían pagar e interpretaban las normas vigentes en la Nueva España.
En 1548, se creó la Real Audiencia de Guadalajara que funcionó como subalterna a la de la Ciudad de México hasta que en 1572 se convirtió en autónoma.
Se convirtió en el Poder Judicial cuando México logró su Independencia.